TOPO克隆原理 克隆原理：Topo载体两端通过磷酸键偶联Topo酶，连接反应时，受插入片段的5'端羟基的攻击，磷酸键释放能量。 利用该能量，插入片段5'端羟基与载体片段3'端磷酸基团连接在一起，Topo异构酶从载体分子上脱落，完成连接反应。 零背景载体：Hieff Clone® Zero Topo载体骨架中含有ccdB致死基因。 当载体发生自连时，ccdB基因完整，会表达ccdB毒素蛋白，导致细菌死亡；当插入片段成功连接时，ccdB基因不完整，ccdB基因不能完整表达，细菌存活。